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中药成分质谱分析新技术与新策略进展中药成分分析检测

时间:2024-07-11 18:36:52 作者:小编 阅读:0°C

1、色谱‐质谱联用分析技术中药成分鉴定质谱技术与策略离子淌度质谱技术,其在中药成分分析和鉴定中的应用也会越来越多。,进而影响中药成分的识别和鉴定[15]。,提高中药成分的鉴定效率和覆盖度[21]。质谱采集模式汤中66个成分的鉴定[24]。质谱数据处理策略、有效的中药研究体系。

文献来源

抽象的

概括

中药是一个复杂的分子体系,如何全面高效地分析中药成分是中药研究的难点。质谱分析技术,特别是超高效液相色谱与高分辨质谱联用技术,具有高选择性、高灵敏度、高质量准确度的特点,是分析中药成分的有力手段。近年来,多功能混合质谱带来的新型质谱数据采集技术和数据处理策略也不断发展,如全信息串联质谱(MSE)技术、SWAT H技术、质谱树相似性过滤技术(MTSF)和分子网络策略(MN),加速了中药成分分析的进程。本文综述了新型质谱分析技术和策略在中药成分分析中的应用,包括色谱-质谱联用和离子淌度技术,以及质谱参数设置、采集模式和数据处理策略,并对其前景进行了展望。

中医药是中华民族几千年医学发展的宝贵财富。中药成分复杂,其功效和作用机理一直备受关注。系统分析中药复杂成分,深入研究中药成分的生物学特性和功效,是理解中药作用原理和作用机制的关键。

基于分离、富集与纯化技术,从药用植物中提取、分离、纯化天然产物,利用红外光谱、核磁共振波谱仪等方法对化合物进行结构分析,解读药用植物的次生代谢产物,发现了许多新类型、新骨架、新结构的药用成分,丰富了天然产物的结构信息,为中药复杂成分的分离分析奠定了坚实的基础。鉴于中药化合物/制剂复杂、多样、痕量的特点,经典的植物化学研究方法难以满足中药化合物/制剂快速、高通量、全成分定性定量分析的需求。随着科技的飞速发展,人们不断探索新的分析技术,建立中药成分分析的新策略,推动中药复杂成分分析研究。 特别是色谱-质谱分析技术和数据处理策略的发展,极大地促进了中药复杂成分的快速、高通量定性和准确定量。

1.色谱-质谱分析技术

色谱-质谱分析技术快速高效、灵敏度高、选择性好,可提供丰富的结构信息,提高复杂体系中微量成分的鉴别和鉴定效率,目前已广泛应用于中药成分的分析鉴定。特别是液相色谱-质谱(LC-MS)技术,其液相色谱部分已由高效液相色谱(HPLC)发展到超高效液相色谱(UPLC)/超高压液相色谱(U HPLC),由一维液相色谱(1D-LC)发展到二维液相色谱(2D-LC)。质谱部分多为高分辨质谱,如飞行时间质谱(TOF)、四极杆-飞行时间质谱(Q-TOF)、傅里叶变换离子回旋共振质谱(FT-ICR)和轨道离子阱质谱(Orbitrap)。与高效液相色谱相比,超高效液相色谱分离效率更高,分析速度更快。 与高分辨率质谱联用在中药成分分析鉴定中优势明显。董等[1]采用U HPLC-QTOF/MS技术对滋补脾阴方中的155个成分进行了定性分析,在50 min梯度洗脱条件下,各成分分布均匀,分离良好。李等[2]建立U HPLC-QTOF/MS技术在TOF动态范围增强(DRE)模式下对中药利舒康胶囊中的成分进行分析。分析过程中,若流出物浓度较高,达到信号饱和,TOF会自动切换到低灵敏度模式,以测定成分的准确质量数,获得了未知成分的高质量一级和二级高分辨率数据,鉴定了利舒康胶囊中的278个成分,其中9个为新化合物。徐等[3]建立U HPLC-Orbitrap-MS方法快速分析鉴定丹红注射液中的117个成分。 每个样品的分析时间仅需26 min,超高效液相色谱-质谱技术与传统的提取、分离和鉴定技术相比,在中药成分分析鉴定的数量、效率和通量等方面发生了质的变化。

二维液相色谱因峰容量高(理论峰容量可达10000个)特别适合于复杂样品的分析[4]。通过最大限度地提高一维和二维液相色谱之间的正交性,扩大色谱峰分布,可以分析和鉴定更多的成分。二维液相色谱有全二维(LC×LC)和多中心切割(HMC)两种分析模式。随着超高效/超高压液相系统耐压性能的不断提高,精密流速和多通道进样阀切换自动化技术的成熟,超高效/超高压二维液相色谱已成为主流并与高分辨率质谱联合用于中药成分的分析鉴定。瞿等。 [5]建立了LC×LC-QTOF/MS技术对雷公藤多苷片中的132个生物碱和三萜类化合物进行了定性和鉴别,解决了以往一维液相色谱分析中出现的峰重叠、基线干扰、鉴别成分数量少(约20个)等技术难题。若将全二维与多中心切割模式联合使用,也有助于提高鉴别的中药成分数量。一般先在全二维模式下进行整体表征,再结合多中心切割模式有针对性地进行成分鉴别。例如乔等[6]采用全二维液相色谱结合QTOF/MS对中药葛根黄芩汤进行定性和鉴别,该方法峰容量高(1628个),正交性好(84%)。 该方法在较短的时间内(42 min)鉴定出280个成分,指认出125个成分。在此基础上结合多中心切割分析模式,降低高含量成分的干扰,补充鉴定了葛根黄芩汤中13个微量成分。盛等[7]将综合二维与多中心切割分析模式结合起来,对中药灯盏生脉的成分进行全面的表征:先采用综合二维模式对灯盏生脉的283个成分进行鉴别和指认。对于综合二维模式下难以分离的异构体,采用手性色谱柱作为第二维分析柱在多中心切割模式下进行分离,补充鉴定了灯盏生脉中的12对异构体。

气相色谱-质谱联用技术(GC-MS)是分析鉴别中药挥发油成分的重要手段,NIST和Wiley标准谱库提供了化合物的质谱信息,可实现快速、准确的鉴别。气相色谱由一维(GC)发展到二维(GC×GC),峰容量明显提高,组分分离能力增强。气相色谱-质谱联用技术由气相色谱-四极杆质谱联用(GC-MS)发展到气相色谱-三重四极杆质谱联用(GC-MS/MS)和气相色谱-飞行时间质谱联用(GC-TOF/MS),提高了质谱数据的质量精度和准确度以及检测灵敏度。王等[8]利用GC-MS结合NIST11数据库对不同产地白香木提取物和沉香挥发油成分进行了分析鉴别,实现了不同产地药材的快速区分。赵等[9]利用GC-MS结合NIST11数据库对不同产地白香木提取物和沉香挥发油成分进行了分析鉴别。 [9]利用GC-TOF/MS技术对肉豆蔻不同部位(仁、果皮、叶)中59种挥发性成分进行鉴定并计算其相对含量,为肉豆蔻的质量控制提供数据支持。何等[10]通过水蒸气蒸馏法获取中药柴胡疏肝散的挥发油成分,建立了GC×GC-MS分析技术。分析参数的细致优化大大提高了GC×GC-MS的分离能力,GC-MS分离后形成的3个色谱峰在GC×GC-MS中被鉴定为6个中药成分。分离能力的提高有助于研究人员对柴胡疏肝散挥发油中的216个萜类化合物及苯酞类化合物进行鉴定和定性。

与GC-MS兼容的样品前处理技术也在不断发展,从普通的直接进样、顶空进样发展到顶空固相微萃取(HS-SPME)和单滴液-液微萃取(SDME)。这些新的前处理技术将萃取、富集和进样步骤整合在一起,提高了分析效率,拓展了GC-MS的应用领域。例如,冯等[11]采用超声/微波辅助顶空固相微萃取(UMHE-HS-SPME)技术结合GC-MS分析,鉴定了白芷中的85种挥发性成分。与传统水蒸气蒸馏法相比,可以提取出更多的白芷挥发性成分,而且只需10分钟,整个过程不需要有机溶剂。中药非挥发性成分的分析比较困难,衍生化反应可以解决一些问题,但由于衍生化反应效率、反应产物稳定性等不利因素,限制了GC-MS在非挥发性成分的应用。

色谱-质谱联用技术是中药成分分析鉴定中不可缺少的技术之一,只有根据中药成分的结构特点和理化性质选择合适的分析技术,才能准确、高效地实现中药复杂成分的分析鉴定。

2. 中药成分质谱鉴别技术与策略

质谱技术在分辨率、准确度、灵敏度等方面不断提升,特别是新型多功能混合质谱技术,为复杂成分的分析鉴定提供了多种扫描模式和碎裂方式,同时可以获得分辨率高、准确度好、覆盖面广的质谱数据,为成分鉴定提供了高质量的数据支持。但与此同时,这些多维数据的分析利用也成为新的制约因素。因此,针对中药成分鉴定的质谱新技术与策略成为研究热点。

2.1 离子迁移质谱

离子淌度质谱(IM-MS)是将离子淌度谱与质谱相结合的技术。离子淌度基于化合物的碰撞截面(CCS)进行分离,可以识别形状和大小相似的成分,特别适合于异构体和结构相似的成分的分析。在色谱分离后使用离子淌度,可以大大提高分析鉴别成分的能力。传统中药三七中多为结构相似的皂苷类成分,它们以多糖为主,分子量较大,色谱分离难度大,程等[12]采用U HPLC-QTOF/MS技术对三七中的53个皂苷类成分进行了鉴定。为了更全面地表征竹节参中的有效成分,张等[13]对竹节参中的皂苷类成分进行了分析。 [13] 将UHPLC-QTOF/MS与离子淌度技术相结合(UHPLC/IM-QTOF/MS),获得了化合物保留时间、CCS值、一级质谱、二级质谱的四维数据。结果表明,竹节参中很多皂苷成分含有5种以上的异构体,即使用UHPLC也难以分离。离子淌度技术提高了该类皂苷成分的分离能力,共鉴定并定性了178个皂苷成分,其中75种成分在竹节参中未见报道,充分展示了其在中药异构成分分析鉴定方面的能力。UHPLC/IM-QTOF/MS还用于对中药血栓通胶囊中的成分进行了鉴定[14]。 鉴定出的中药成分数量比UHPLC-Q/Orbitrap-MS提高了4倍(从52种增加到230种),解决了血栓通胶囊成分表征不足的问题。随着国内外学者对IM-MS的深入研究和更多组合技术的开发,其在中药成分分析鉴定中的应用将会越来越普遍。

2.2 质谱采集参数设置

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中药成分的鉴别与鉴定依赖于高质量的质谱数据。高分辨率质谱技术是当今的主流仪器,如飞行时间质谱(TOF)、四极杆飞行时间质谱(Q-TOF)、傅里叶变换离子回旋共振质谱(FT-ICR)、静电场轨道离子阱质谱(Orbitrap),在中药成分的鉴别与鉴定中各有优势。除了仪器硬件和软件的差异外,使用过程中采集速率、分辨率、母离子质量窗口、碎裂电压、碰撞能量等参数的设置也会直接影响质谱数据,从而影响中药成分的鉴别与鉴定[15]。

采集速率用来表示质谱仪在单位时间内采集到的光谱数目。中药未知成分的鉴别需采用非靶向模式,因此采集尽可能多的光谱以获得完整的质谱信息对于成分鉴别至关重要。飞行时间质谱是采集速率最快的质谱仪,与超高效液相色谱联用,适合于在复杂体系中发现中药成分。一般QTOF每秒可获得2~100张高分辨率全扫描光谱,基本满足中药成分的分析需求。但TOF技术本身无法提供二次质谱信息,难以准确鉴别中药成分,因此常与四极杆质谱联用,即Q-TOF,可同时提供高分辨率的一次和二次质谱数据。魏等[14]。 [16]采用正负离子模式下的UPLC-Q-TOF/MS对化湿败毒方中的217个中药成分进行了定性和鉴别,该方法可在20 min内完成化湿败毒方主要成分的质谱数据采集,充分体现了TOF快速定性分析的优势。对于TOF这样的质谱分析仪来说,仪器采集速率基本不会影响分辨率,但会影响灵敏度,因此一些大型仪器厂家致力于设计和改进TOF的硬件或软件配置,使其在高采集速率下,兼具高灵敏度和宽动态范围。例如Waters公司推出的Xevo G2-S QTOF在离子源处采用了专利的堆积环组件进行离子聚焦和引导,显著提高了离子传输效率,使质谱仪的灵敏度提高了25倍以上; 安捷伦推出的6550QTOF可以基于预先设定的母离子列表进行MS/MS采集,显著提升了QTOF的靶向采集能力,适合针对性地鉴定低丰度的中药成分。TOF的缺点是不具备级联功能,即使与四极杆联用也只能提供二级质谱数据。因此,当需要多级质谱数据来推断或确认中药成分结构时,TOF的应用受到限制,必须与其他级联质谱仪联用。

高分辨质谱仪的分辨率通常在1万~25万(FWHM)之间,对于中药成分鉴别,几万至几十万的分辨率基本可以满足分析要求。近年来,大型仪器厂商也推出了一些超高分辨率质谱仪,如Thermo公司的Orbitrap Fusion质谱仪,分辨率可达45万(FWHM),Bruker公司的傅里叶变换离子回旋共振质谱仪(FT-ICR),分辨率可达100万(FWHM)。FT-ICR技术以其高灵敏度、超高分辨率、超高质量数精度及多级质谱功能,在中药复杂成分鉴别鉴定方面具有独特的优势。刘等。 [17]建立了U型HPLC-FT-ICR-MS分析方法,获得了葛根芩连汤成分的高精度(<2 ppm)多级质谱数据,可在25 min内对葛根芩连汤中的134种成分进行鉴定和鉴别。张等[18]应用FT-ICR对萜烯酸类、有机酸类、黄酮类、倍半萜类、香豆素类、蒽醌类等6类中药成分的质谱碎裂规律进行分析总结,实现了茵陈五苓散中138种成分的鉴定。静电场轨道离子阱质谱也具有分辨率高、质量精度高的优势。 尤其是以Thermo公司推出的四极杆-静电场轨道阱混合质谱仪(Q Exactive)系列为代表的质谱仪,通过源内捕获,能够实现更高的离子传输速率和离子脱溶,同时具有较高的灵敏度。例如刘等[19]建立了U HPLC-Q-Exactive-Orbitrap-MS分析技术,仅需2 μL进样量就能够对中药清肺排毒方中的405种成分进行鉴别和鉴定。值得一提的是,虽然硬件的设计和改进逐渐使得质谱仪能够兼具高分辨率和高灵敏度,但是FT-ICR和Orbitrap的分辨率和采集速度是相互制约的,例如当Thermo公司的Q Exactive HF质谱仪分辨率达到240 000时,采集速度会下降到1.5张谱图/秒。因此,实验过程中仪器参数的合理设置至关重要。

前体离子质量窗口设置的宽度与数据采集的灵敏度和选择性有关,较窄的质量窗口可以提高分辨率和选择性,但会滤除大部分前体离子,可能造成信息丢失。因此,较宽的前体离子质量窗口(1~3u)更适合中药成分的分析鉴定。碎裂电压和碰撞能量的选择会直接影响二次质谱的碎裂信息,设置多个碰撞能量碎裂[20],获取分析对象在各个碰撞能量下的碎裂信息,并与质谱数据库进行匹配,有助于鉴定尽可能多的中药成分。另外,目前很多质谱仪支持快速正负极性切换。中药成分的结构和性质千差万别,电荷分布和电离特性各有不同,应用正负极性快速切换扫描模式,可以获得高质量的未知成分质谱数据和碎裂信息,从而提高中药成分的鉴定效率和覆盖率[21]。

2.3 质谱采集模式

全扫描模式是质谱仪最常用、最简单的一级质谱数据采集模式,可以获得准分子离子及分子量信息。二级质谱数据的采集通常需要选择采集模式,不同仪器厂家的高分辨率质谱仪都有各自的专利技术。目前高分辨率质谱的二级质谱数据采集模式主要有数据相关采集(DDA)和数据非相关采集(DIA)。在DDA过程中,质谱仪先进行全扫描,然后选择符合一定条件的前体离子引发二次碎裂,选择原则包括丰度、电荷、动态排除和背景减法。DDA模式通过预筛选前体离子,降低了干扰离子的存在,可以获得碎片离子的高质量数据,也是最常用的采集模式。王等。 [22] 在HPLC-QTOF/MS的DDA模式下收集了牛黄上清丸中未知成分的碎片信息,鉴定出190个成分。但DDA作为选择性采集方法,覆盖率较低。一般来说,强度较高的离子更容易被选为目标离子进行二次质谱信息采集。因此,当一些关键成分的有价值离子不符合筛选条件或与许多强度较高的离子共流出时,存在丢失的风险。这意味着中药中的许多微量成分往往难以获得高质量的碎片离子信息,难以鉴定。

DIA模式无需预先筛选母体离子,理论上可以全面获得所有离子的碎裂信息,目前已发展了一些DIA策略,如全信息串联质谱(MSE)技术(由Waters公司开发)和SWATH技术(由AB SCIEX和ETH Zurich开发)。齐等[23]采用U HPLC结合Waters Q-TOF SYNAPT G2质谱仪的MSE采集模式,对乌头汤中的生物碱、三萜皂苷、黄酮类化合物等74种成分进行了鉴定,还利用MSE模式对四君子汤中的66种成分进行了鉴定[24]。以上两项研究利用MSE模式碰撞能量线性增加的特点,在最佳碰撞能量下对中药成分进行碎裂,获得了未知成分的高分辨率一级质谱和碎片离子信息,提高了鉴定的准确性。 DIA采集数据相对全面,但数据量大、谱图复杂、数据反卷积困难,即便是采用母离子分段传输(25u)的SWATH技术也只能在一定程度上缓解后处理数据的压力。相较于DDA现有的大量成熟分析工具,DIA数据处理软件尚处于发展阶段,目前MS-DIAL软件可以支持小分子化合物的鉴定和鉴别,而OpenSWATH、DIANA、pSMART、DIA-Umpire等DIA软件仅适用于蛋白质组学平台。

在中药复杂成分分析鉴别方面,DDA与DIA模式各有优缺点,二者结合取得了良好的效果。马某等[25]将QTOF/MS的MSE采集模式与QTrap/MS的DDA采集模式相结合,对中药保元汤中的236个成分进行了鉴别:首先采用UPLC-QTOF/MS的MSE模式,全面收集保元汤的成分信息,对含量相对较高的成分进行鉴定;然后,采用UPLC-QTrap/MS的多种DDA采集模式,如预测离子对扫描模式(pMRM)、多离子检测-增强产物离子扫描模式(MIM-EPI)等,对保元汤中的微量成分进行鉴别和定性鉴定。 两种采集模式的结合,不仅发挥了全面鉴别的优势,提高了鉴别覆盖率,而且可以对结构上难以鉴别的微量成分进行表征,从而提高未知中药成分的鉴别深度。另有蛋白质组学实验结果表明[26],DIA模式与离子淌度相结合,可以有效降低肽谱的复杂性,提高检测灵敏度和深度。因此,DIA模式与离子淌度相结合将对中药中复杂成分的分析具有很大的促进作用。

2.4 质谱数据处理策略

质谱数据蕴含着丰富的结构信息,通过总结化合物结构相关规律并建立数据库,已被证明在中药成分鉴定中行之有效,克服了中药成分分析鉴定中标准品缺乏、数据库标准谱图有限的瓶颈。研究人员不断探索总结化合物质谱裂解规律,整合多种数据处理分析方法,形成了多种商业化的质谱数据处理策略。

常见的质谱数据处理策略包括背景减法(BS)、质量亏损过滤(MDF)、产物离子过滤(PIL)、中性丢失过滤(NLF)和主成分分析(PCA)。乔等[27]将多种中性丢失/前体离子扫描与主成分分析策略相结合,对姜黄中的姜黄素进行鉴定:通过中性丢失/前体离子扫描发现了大量潜在的姜黄素;主成分分析将未知的姜黄素按不同的质谱碎片特征进行分类,以方便推断未知成分的结构,最终鉴定出864种姜黄素。融合多种质谱数据的鉴定模式,能充分发掘相似的未知成分,具有全面性、系统性的优点,缺点是需要对大量的质谱数据逐一进行分析进行鉴定,速度较慢。 因此,将上述质谱数据处理策略与化学信息学、计算科学相结合,产生了一些针对中药复杂成分具有更好选择性和效率的数据处理策略,包括:基于模板化合物的质谱树相似性过滤技术(MTSF)[26-27]、基于碎片指纹特征的未知化合物从头鉴定的“碎片树”(FTs)策略[28]、基于二级碎片相似性得分的分子网络(MN)[29-30]、基于分子描述符的化合物预测策略[31]。

质谱的相似性过滤技术(MTSF)使用该化合物的主要高分辨率质谱数据作为“树干”和多级别的质谱数据,作为“分支机构”的相似性,以计算wang seconding and senling secondents nisten和sidement secents secondipers nisten secents the Mentiph secondipers。 362个识别的象征是通过计算3362个电势化合物和小氧化物的14个模板化合物的377个相关组成部分的相似性,而近90%的干扰信息被消除了,并且确定了近90%的组成部分,则可以仔细地识别了377个相关组成部分。张等。 [29]应用了MTSF技术,并将已知的绿酸成分作为模板,以识别18个主要类别的115个氯化酸成分。基于片段树的代表性识别软件是Sirius,已更新到版本4.0(Sirius 4)[30],可以广泛预测小分子化合物的结构,例如药物,天然产物和代谢物等全球自然产品的社交网络(GNPS)的组成。引起了很多关注。 [32]使用GNPS平台来识别和识别中医pingxiao胶囊中的类黄酮,有机酸和其他成分,并构建了156个在Pingxiao胶囊中的511个潜在组成部分的分子网络,不仅可以与不知名的组成部分进行分类。碎片离子提供的信息,在pingxiao胶囊中的89个成分被鉴定出分子网络有效地提高了通过计算已知组件的分子描述来构建的QSRA效率,也可以通过软件的结构来预测QSSRA的结构。 ISH未知的异构体。 [33]使用了17个共同替代成分的6个分子描述子来建立QSRA模型,并通过保留时间预测了Shengmai注射中的46个人参固醇成分,并有效地区分了其中的异构体。

总体而言,上述新策略部分解决了传统识别过程中存在的问题,例如有限的标准,大量工作量和不合时宜的数据库更新,但其识别结果的准确性仍然需要改善。

3.结论和前景

现代分析测试技术的剧烈发展和研究策略的持续出现,为中医的物质基础和作用机制而破坏了大量的研究。传统中医研究系统。

-结尾-

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